麻豆久久久久久久_四虎影院在线观看av_精品中文字幕一区_久在线视频_国产成人自拍一区_欧美成人视屏

長春市一體化逆轉錄酶

來源: 發布時間:2023-11-21

miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR,miRNA與mRNA的在qRT-PCR過程有所不同。一般來講,mRNA比較長,其長度通常在幾百至幾千個核苷酸,因此使用隨機引物(RandomPrimerp(dN)6)即可隨機結合到mRNA的各位置進行逆轉錄。由于qPCR的過程只需擴增目的片段的一部分(80~200bp),因此使用隨機引物的逆轉錄產物盡管不完整,也完全能夠滿足qPCR的需求。當然,也可以使用OligodT引物統一從mRNA的ployA尾巴開始逆轉錄。這種逆轉錄引物在擴增cDNA全長時是必須的,但要注意,原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾,因此不能使用OligodT引物進行逆轉錄。酵母菌逆轉錄酶是逆轉錄酶家族中的一個重要表示。長春市一體化逆轉錄酶

反轉錄酶的用處:由它催化轉錄合成的DNA稱為互補DNA(cDNA)。通常情況下,細胞內的轉錄應由DNA到RNA的,所得RNA為信使RNA(mRNA)供蛋白質合成作模板用。而在部分RNA病毒中,要實現自身擴增,必須具有DNA,因此先由RNA逆轉錄合成cDNA再由cDNA轉錄出RNA。逆轉錄酶可用RT—PCR,將RNA轉變為DNA后擴增,以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發現了反轉錄酶,并認為此酶與病毒的致死性質有關。反轉錄酶也分布于某些正常細胞和胚胎細胞。反轉錄酶的發現表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質非常化,遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究,已成為研究這些學科的有力工具。南京莖環法逆轉錄試劑生產商逆轉錄的目的是將RNA變為DNA,便于PCR擴增。

RT-PCR逆轉錄中模板的選擇:在RT-PCR實驗中,選擇總RNA或純化的mRNA作為模板進行逆轉錄十分重要。mRNA雖然能提供略高的靈敏度,但總RNA經常使用,具有較mRNA更重要的優勢。首先,其過程需要較少的純化流程,這保證了更好的回收模板和更好的把結果標準化為起始的細胞數。第二,避免mRNA富集步驟,為了避免不同mRNA的回收率而帶來結果偏移的可能性。總之,在大多數的應用中,目標基因的相對定量比檢測的非常靈敏度更重要,因此在多數情況下,總RNA更適用。

逆轉錄酶實驗流程:從細胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆轉錄酶、引物、dNTPs的反應體系中→退火,引物與RNA鏈配對→延伸,逆轉錄酶合成互補cDNA鏈變性→常規PCR反應流程(變性、退火、延伸,如此多次循環)。RT-PCR“兩步法”與“一步法”RT-PCR的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需構建cDNA文庫(即cDNA合成與PCR反應在同一Buffer及酶中進行,一步法完成),省略了cDNA與PCR之間的過程。兩步法RT-PCR首先用反轉錄酶合成cDNA,然后以cDNA為模板進行PCR,即RNA反轉錄與PCR擴增分兩步進行。逆轉錄是2代測序、單細胞測序等技術的前置步驟。

逆轉錄酶的合成步驟:1、使用前每個組份輕輕混勻,然后2000rpm離心20s;2、取滅過菌且無核酸酶的0.2ml離心管,依次加入2~5μgRNAnμL;3、65℃保溫5min,然后冰浴5min;4、往3步驟中的0.2ml離心管依次加入下列組份:RNase抑制劑(40u/μL)0.5μL、10×M-MLVReactionBuffer2μL、DTT(200mM)1μL、逆轉錄酶(M-MLV)1μL;5、輕輕混勻后,然后2000rpm離心20s;6、先在37℃保溫1hr,然后70℃保溫15min;7、上述產物可立即進行下一步的PCR反應或-20℃保存。逆轉錄酶的質量控制:物理純度:在SDS-PAGE上>90%純。儲存緩沖液:20mMTris-HClpH7.5;200mMNaCl;0.1mMEDTA;1mMDTT;0.01%NP-40(一種去垢劑)和50%甘油。反應緩沖液:250mMTris-HClpH8.3;375mMKCl;15mMMgCl2;50mMDTT(以Part#M531A供應)。逆轉錄實驗前要對反應體系進行無RNA和無反轉錄酶的對照。南京莖環法逆轉錄試劑生產商

質粒RNA檢測中的逆轉錄反應需要特定反應體系。長春市一體化逆轉錄酶

反轉錄酶(reversetranscriptase,也可寫成逆轉錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發現了一種特殊的DNA聚合酶,該酶以RNA為模板,以dNTP為底物,tRNA(主要是色氨酸tRNA)為引物,在tRNA3'-OH末端上,根據堿基配對的原則,按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈,這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA,CDNA)。反轉錄酶(Reversetranscriptase)是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA(cDNA)的酶。哺乳類C型病毒的反轉錄酶和鼠類B型病毒的反轉錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉錄酶則由兩上亞基結構。真核生物中也都分離出具有不同結構的反轉錄酶。長春市一體化逆轉錄酶

主站蜘蛛池模板: 超碰偷拍| 午夜精品一区二区三区免费视频 | 欧美日韩欧美日韩 | 亚洲精品一区二区三区在线 | 综合精品 | 一级特色黄大片 | 国产中文字幕一区 | 精品久久久久久久久久久久久久久久久久 | 精品乱子伦一区二区三区 | 伊人春色在线播放 | 日韩www| 国产精品久久久爽爽爽麻豆色哟哟 | 亚洲综合在线视频 | 免费在线成人网 | 国产精品久久久久免费a∨ 欧美黄色精品 | 国产剧情一区二区 | 亚洲一区二区av | 日日摸夜夜添夜夜添特色大片 | 中文字幕乱码亚洲精品一区 | 中文字幕在线观看一区 | 中文在线一区二区 | a级性生活片 | 韩国av一区二区 | 国产视频久久 | 国产一区日韩在线 | 老妇女av | 黄色一级大片免费看 | 国产在线精品一区 | 成人性大片免费观看网站 | 天天澡天天狠天天天做 | 久久99这里只有精品 | 婷婷精品 | 欧美一区二区三区男人的天堂 | 91cn国产在线 | 最近日本韩国高清免费观看 | 男女视频网站 | 激情久久久久 | 精品欧美乱码久久久久久1区2区 | 热久久影院 | 在线免费观看黄色 | 免费看少妇高潮一级毛片特黄 |