逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成與其互補的cDNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)和cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)相結(jié)合的技術，故逆轉(zhuǎn)錄稱為RT-PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR。逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗原理是，提取組織或細胞中的總RNA，以RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA鏈為模板進行PCR擴增，從而獲得大量拷貝。逆轉(zhuǎn)錄PCR的出現(xiàn)使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：選擇合適的引物：隨機引物法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的片段較小，很難得到全長轉(zhuǎn)錄本的cDNA。單獨選擇某一種引物，實驗可能都不完美，具體需要根據(jù)實驗目的來確定。核酸合成與轉(zhuǎn)錄過程與遺傳信息的流動方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。南京miQP2逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄實驗的準備工作：1、實驗器具與材料：（1）移液頭：200ul、10ul；（2）吸頭：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、實驗器具的處理與準備，塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準備：（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1。5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆谩＃?）RT中所需要的各種試劑。重慶快速反轉(zhuǎn)錄制造商逆轉(zhuǎn)錄PCR在檢測病毒、診斷疾病等方面有普遍應用。

人體中也有逆轉(zhuǎn)錄過程，比如端粒的復制。端粒（telomere）是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由重復的DNA序列（TTAGGG）和核的蛋白組成，可以保護染色體末端，維持基因組完整性。端粒的末端是單鏈3'末端，形成一種緊湊的T環(huán)結(jié)構(gòu)，可保持其穩(wěn)定性。其表面覆蓋著Shelterin復合物，包括TRF1（端粒重復結(jié)合因子1）、TRF2（端粒重復結(jié)合因子2）、TIN2（TRF1相互作用核的蛋白2）、RAP1（rif相關蛋白）、POT1（端粒保護）和TPP1（端粒保護蛋白1）成功將人表皮干細胞體外分離培養(yǎng)的基礎上，對比觀察不同發(fā)育階段人表皮干細胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達的差異特征，結(jié)果表明人胚胎、少兒、成人皮膚來源的表皮干細胞均有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達，其表達強度依次減弱。提示誘導和增強端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達對維持表皮干細胞在體外自我更新和增殖能力可能具有重要意義。

miRNA逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)法：首先需要進行RNA樣品制備，可選的方法有：離心柱法抽提（不必去除gDNA）；傳統(tǒng)Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分別設計。是否采用通用引物視情況而定，正向引物與通用反向引物不會形成二聚體時才能用。取200ul的PCR管，根據(jù)所得每組RNA的濃度C，每孔加入1000ng總RNA，按公式1000ng/C計算出所需RNA的體積x。然后按建議的20μL反應體系說明，依次向200μL的PCR管內(nèi)加入下列試劑：加樣結(jié)束后，移液器吹打混勻，低速離心數(shù)秒。將逆轉(zhuǎn)錄PCR管放入PCR擴增儀內(nèi)，調(diào)整參數(shù)：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應），85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應），4℃∞。反應結(jié)束后根據(jù)實驗需要進行熒光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。說明：此處可以選擇U6下游引物作為U6的逆轉(zhuǎn)錄引物，注意相應地調(diào)整無酶水的體積和反應溫度。高效的逆轉(zhuǎn)錄體系可提高反應效率和檢測靈敏度。

加尾法逆轉(zhuǎn)錄的較大特點在于：對于抽提純化的miRNA，進行無差別加尾。因此，如果用戶需要對樣本中的多個miRNA進行考察，一次逆轉(zhuǎn)錄即可完成對所有qPCR模板的制備。qPCR引物方面，miRNA以及內(nèi)參的反向引物都是通用引物R，不同的只是正向引物。因此在設計加尾法miRNA的qPCR引物時，只需設計特異性正向引物即可，正向引物的特異性直接決定了實驗結(jié)果的好壞。總之，加尾法適合對樣本中多個miRNA的快速檢測。引物設計簡單，但有非特異性的風險。由于其特殊的加PolyA機制，因此miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄是無法只通過常規(guī)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成的。逆轉(zhuǎn)錄技術應用于人類基因組的研究。南京miQP2逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄過程的揭示是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)，是對中心法則的重要修正和補充。南京miQP2逆轉(zhuǎn)錄酶

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比AMV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性，因此要獲得像AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應中產(chǎn)生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA，要用8單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶才相當于1單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制，該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉(zhuǎn)錄酶5X反應緩沖液，也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液，因為這二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉(zhuǎn)錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染，逆轉(zhuǎn)錄實驗過程需適當?shù)腞NA質(zhì)量，過少或質(zhì)量不佳將影響擴增效果。南京miQP2逆轉(zhuǎn)錄酶